Lompat ke konten Lompat ke sidebar Lompat ke footer
Beranda / APKJT

Media Kultur Invitro Anggrek

Posting Komentar


Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan, sangat bergantung pada media yang digunakan. Media kultur jaringan tanaman menyediakan tidak hanya unsur hara-unsur hara makro dan mikro, tetapi juga karbohidrat yang pada umumnya berupa gula menggantikan karbon yang biasanya didapat dari atmosphere melalui fotosintesis. Hasil yang lebih baik akan dapat kita jangkau/peroleh, bila ke dalam media tersebut ditambahkan vitamin-vitamin, amino acid, dan zat pengatur tumbuh. Walaupun sudah diusahakan untuk menghindarkan penggunaan komponen-komponen yang tidak jelas (komponennya) seperti juice, yeast ectracts dan casein hydrolysate, tetapi kadang-kadang kita bisa memperoleh hasil yanglebih tingi dengan penambahan tesebut. Sebagai contoh, air kelapa masih sering digunakan di laboratorium penelitian, sedangkan pisang masih merupakan komponen tambahan yang sangat populer pada media anggrek.
A. Bahan untuk Pembuatan Media Kultur Jaringan

Media kultur tersusun dari beberapa atau seluruh komponen berikut.
  1. Hara makro yang digunakan pada semua media.
  2. Hara mikro hampir selalu digunakan. Ada beberapa komposisi media media yang hanya menggunakan besi atau besikelat.
  3. Vitamin-vitamin, umumnya ditambahkan  dalam  jumlah yang bervariasi.
  4. Gula, merupakan keharusan, kecuali untuk tujuan yang sangat khusus.
  5. Asam amino dan N organik.
  6. Persenyawaan-persenyawaan kompleks alamiah seperti: air kelapa, ekstrak ragi (yeast extract), juice  tomat,  ekstra kentang, dan sebagainya.
  7. Buffer, terutama buffer organik.
  8. Arang aktif. Sering dipergunakan untuk menstimulir pertumbuhan akar.
  9. Zat pengatur tumbuh : terutama auksin dan sitokinin. Zat pengatur tumbuh merupakan komponen yang sangat penting dalam media kultur jaringan. Tetapi jenis dan konsentrasinya sangat tergatung pada jenis tanaman dan tujuan kulturya.
  10. Bahan pemadat. Untuk membuat media padat, biasanya digunakan agar.

Macam-macam metode pada teknik kultur jaringan dapat ditinjau dari macam media tanam, eksplan yang dipakai atau bahan, dan cara pemeliharaannya. Berdasarkan dari macam media tanam yang dipakai, metode kultur dibedakan sebagai berikut :

a. Metode Padat (Solid Method)

Metode padat atau solid method adalah teknik kultur jaringan dengan menggunakan media padat. Media padat ialah media yang didalamnya terkandung semua komponen komponen kimia yang dibutuhkan oleh tanaman tersebut yang kemudian akan dipadatkan dengan menambahkan suatu zat pemadat. Zat pemadat dapat berupa agar-agar batangan, bubuk, ataupun sebuah kemasan kaleng yang biasanya dipakai untuk media padat pada teknik kultur jaringan. Metode padat atau solid method ini banyak digunakan guna teknik kloning, untuk menumbuhkan protoplasma setelah diisolasikan, dan kegunaan yang lainnya. Perlu diketahui juga bahwa penggunaan media yang terlalu padat akibatnya membuat akar sukar untuk tumbuh karena akar akan sulit menembus ke dalam media sehingga membuat proses kultur cenderung gagal.

b. Metode Cair (Liquid Method)

Metode cair atau liquid method adalah teknik kultur jaringan dengan menggunakan media cair. Media cair dapat berupa larutan nutrien tanpa harus memerlukan zat pemadat. Pembuatan media cair ini cenderung lebih cepat, namun kurang praktis sebab apabila terlalu cair dapat menyulitkan pertumbuhan eksplan menjadi kalus sehingga keberhasilannya yang sangat minim. Pertumbuhan tersebut tidak akan terjadi sebab eksplannya tenggelanm. Oleh karena itu, teknik kultur jaringan dengan menggunakan metode cair pada umumnya digunakan pada eksplan satu diantaranya yaitu suspensi sel.

Apabila ditinjau berdasarkan eksplan atau bahan yang dipakai, metode kultur dibedakan menjadi:

 Kultur Antera

 Kultur Meristem

 Kultur Endosperma

 Kultur protoplasma

 Kultur spora

 Kultur Suspensi sel, dan lain sebagainya

Langkah Pembuatan Media

A. Media Kemasan Jadi

Misalnya untuk membuat 1 liter media dasar MS, ditimbang 4.43 gram media kemasan MS (pada label tertera „4.43 gram untuk 1 liter media‟) dan dimasukkkan dalam gelas beker ukuran 2 liter.  Ukuran gelas beker harus lebih besar volumenya dari volume media yang dibuat untuk menghindarkan tumpahnya media ketika larutan dalam gelas beker mendidih.   Selanjutnya diletakkan di atas magnetic stirrer untuk proses pengadukan dan pemanasan.  Ditambahkan air destilasi (distilled water) dan diaduk dengan stirrer hingga larut.  Kemudian ditambahkan komponen lainnya seperti gula dan juga ZPT jika diperlukan dan dilarutkan kembali hingga benar-benar larut.  Selanjutnya ditambahkan air destilasi hingga volume mencapai 1 liter.  Diukur pH larutan dan pH selanjutnya disesuaikan menjadi 5.6-5.8 dengan menambahkan NaOH atau HCl.  Terakhir dimasukkan pemadat, kemudian dipanaskan hingga mendekati mendidih.  Selanjutnya media dituang dalam botol kultur steril, ditutup rapat dan disterilisasi dengan autoklaf.  Lamanya sterilisasi tergantung volume media, umumnya 20 menit untuk volume media 20-25 ml per-botol.

 

B.  Media Racikan

 Untuk membuat media racikan, maka harus diketahui dulu komponen masing-masing jenis media seperti yang tertera dalam Tabel 1.

 

Tabel 1.  Beberapa Jenis Media dan Komponennya

Komponen

media (mg/liter)

 

Jenis Media

 

Hara makro:

MS

G5

W

VW

NN

Ca3(PO4)2

 

 

 

200.0

 

NH4NO3

1650. 0

 

 

 

720.0

KNO3

1900. 0

2500. 0

80.0

525.0

950.0

CaCl2.2H2O

440.0

150.0

 

 

166.0

MgSO4.7H2O

370.0

250.0

720.0

250.0

185.0

KH2PO4

170.0

 

 

250.0

68.0

(NH4)2SO4

 

134.0

 

500.0

 

NaH2PO4.H2O

 

150.0

16.5

 

 

CaNO3.4H2O

 

 

300.0

 

 

Na2SO4

 

 

200.0

 

 

KCl

 

 

65.0

 

 

K2SO4

 

 

 

 

 

Hara mikro:

 

 

 

 

 

KI

0.83

0.75

0.75

 

 

H3BO3

6.20

3.0

1.5

 

10.0

MnSO4.4H2O

22.30

 

7.0

0.75

25.0

MnSO4.H2O

 

10.0

 

 

 

ZnSO4.7H2O

8.6

2.0

2.6

 

10.0

Na2MoO4.2H2O

0.25

0.25

 

 

0.25

CuSO4.5H2O

0.025

0.025

 

 

0.025

CoCl2.6H2O

0.025

0.025

 

 

 

Co(NO3)2.6H2O

 

 

 

 

 

Na2EDTA

37.3

37.3

 

 

37.3

FeSO4.7H2O

27.8

27.8

 

 

27.8

MnCl2

 

 

 

 

 

Fe(C4H4O6)3.2H2 O

 

 

 

28.0

 

Vitamin dan suplemen lainnya:

 

 

 

 

 

Inositol

100.0

100.0

 

 

100.0

Glycine

2.0

2.0

3.0

 

2.0

Thiamine HCl

0.1

10.0

0.1

 

0.5

Pyridoxine HCl

0.5

 

0.1

 

0.5

Nicotinic acid

0.5

 

0.5

 

5.0

Capanthothenate

 

 

1.0

 

 

Cysteine HCl

 

 

1.0

 

 

Riboflavin

 

 

 

 

 

Biotin

 

 

 

 

0.05

Folic acid

 

 

 

 

0.5

Keterangan: 

MS    = Murashige & Skoog;                

G5     = Gamborg;

W      = White; 

VW   =Vacin &Went;  

Nitsch & Nitsch (Sumber : Saad & Elshahed, 2012).

Komponen    media dasar tersebut pada Tabel 1 juga dijual secara terpisah, sehingga pembuatannya melalui proses pencampuran komponen.  Preparasi media dilakukan dengan pembuatan larutan stok terlebih dahulu. Tujuannya adalah untuk menghindarkan penimbangan banyak komponen secara berulang jika pembuatan media dilakukan berkali-kali.  Selain itu, untuk mempermudah penimbangan hara mikro yang dibutuhkan dalam jumlah sangat sedikit.  Berikut dijelaskan bagaimana pembuatan larutan stok dibuat untuk media dasar MS serta berapa volume yang harus dipipet untuk pembuatan 1 liter media MS. 

Cara pembuatan 500 ml larutan stok adalah sebagai berikut:  tuang air destilasi sebanyak kurang lebih 200 ml ke dalam gelas beker ukuran 1000 ml.  Timbang dan masukkan secara berurutan komponen satu persatu sambil dilakukan pengadukan dengan stirrer.  Jika semua komponen sudah larut, terakhir ditambahkan air destilasi hingga volume mencapai 500 ml.  Sebaiknya digunakan air destilasi steril untuk pembuatan larutan stok.  Tujuannya adalah untuk memperkecil resiko kontaminasi.  Selanjutnya larutan stok yang sudah homogen ini disimpan  pada suhu 4 oC.  Larutan stok Fe-EDTA disimpan dalam keadaan kedap cahaya dengan jalan membungkus botol dengan aluminium foil karena cahaya dapat merusak Fe.


500 ml larutan stok hara makro (Stok A)

Komponen 

Kebutuhan

untuk 1 liter media (mg)

Stok 100 x konsentrasi (mg)

Stok 50 x konsentrasi (mg)

NH4NO3

1650

165000

82500

KNO3

1900

190000

95000

MgSO4.7H2O

370

37000

18500

KH2PO4

170

17000

8500

Volume stok yang harus dipipet untuk 1 liter media

 

 

5 ml

 

10 ml

 

500 ml larutan stok CaCl2.2H2O (Stok B)

Komponen 

Kebutuhan untuk 1 liter media (mg)

Stok 100 x konsentrasi (mg)

Stok 50 x konsentrasi (mg)

CaCl2.2H2O

440.0

44000

22000

Volume stok yang harus dipipet untuk 1 liter media

 

 

5 ml

 

10 ml

 

500 ml stok hara mikro (Stok C)

Komponen 

Kebutuhan untuk 1 liter media (mg)

Stok 100 x konsentrasi (mg)

Stok 50 x konsentrasi (mg)

KI

0.83

83

41.5

H3BO3

6.20

620

310

MnSO4.4H2O

22.30

2230

1115

ZnSO4.7H2O

8.6

860

430

Na2MoO4.2H2O

0.25

25

12.5

CuSO4.5H2O

0.025

2.5

1.25

CoCl2.6H2O

0.025

2.5

1.25

Volume stok yang harus dipipet untuk 1 liter media

 

 

5 ml

 

10 ml

 

 500 ml larutan stok Fe-EDTA (Stok D)

Komponen 

Kebutuhan untuk 1 liter media (mg)

Stok 100 x konsentrasi (mg)

Stok 50 x konsentrasi (mg)

Na2EDTA

37.3

3730

1865

FeSO4.7H2O

27.8

2780

1390

Volume stok yang harus dipipet untuk 1 liter media

 

 

5 ml

 

10 ml

 500 ml larutan stok vitamin (Stok E)

Komponen 

Kebutuhan untuk 1 liter media (mg)

Stok 100 x konsentrasi (mg)

Stok 50 x konsentrasi (mg)

Inositol

100.0

10000

5000

Glycine

2.0

200

100

Thiamine HCl

0.1

10

5

Pyridoxine HCl

0.5

50

25

Nicotinic acid

0.5

50

25

Volume stok yang harus dipipet

untuk 1 liter media

 

 

5 ml

 

10 ml

 

 Pembuatan satu liter media MS dari larutan stok dilakukan dengan jalan menambahkan larutan stok A, B, C, D dan E secara berurutan pada gelas beker ukuran 2 liter yang sudah berisi kurang lebih 400 ml air destilasi.  Volume larutan stok yang dipipet tergantung dari konsentrasi stok yang dibuat dan volume larutan stok.  Misal untuk volume 500 ml stok dengan “50 x konsentrasi”, maka volume yang dipipet adalah 1/50 x 500 ml = 10 ml.  ZPT atau senyawa organik alami (jika diperlukan) ditambahkan sesuai dengan konsentrasi yang dibutuhkan. Selanjutnya ditambahkan gula sebanyak 20-30 gram, diaduk terus hingga homogen. Air destilasi ditambahkan hingga volumenya 1000 ml dan dilakukan penyesuaian pH menjadi 5.6-5.8 dengan menambahkan NaOH (jika terlalu asam) atau HCl (jika terlalu basa).  Setelah penyesuaian pH, ditambahkan pemadat, diaduk terus sambil dipanaskan hingga mendekati mendidih.  Selanjutnya media dituang dalam botol kultur dan diautoklaf.  Lamanya sterilisasi tergantung volume media seperti terlihat pada Tabel 2.  

 

Tabel 2.  Minimal waktu sterilisasi dengan autoklaf yang dibutuhkan media kultur 

Volume media

(ml)

Lama sterilisasi (menit)

25

20

50

25

100

28

250

31

500

35

1000

40

2000

48

4000

63

Sekarang kita identifikasi kembali, silahkan paparkan pengetahuan anda dengan menjawab beberapa pertanyaan pemantik berikut :

  1. Apa yang anda Ketahui tentang Media Kultur?
  2. Faktor apa saja yang menentukan keberhasilan pembuatan media kultur?
  3. Media kultur berdasarkan tingkat kekerasannya ada beberapa macam diantaranya, Medoa padat, Media Semi Padat dan Media Cair, menurut anda mengapa media tersebut berbeda-beda?

Silahkan anda Upload Jawaban anda dan tuangkan dalam sebuah karya sesuai dengan bakat anda, bisa dalam bentuk video/ info grafis/voice note/ catatan dll kemudian uplad di padlet berikut :

Selamat beraktifitas dan tetap jaga kebahagiaanmu

Dibuat dengan Padlet

Posting Komentar untuk "Media Kultur Invitro Anggrek"